MICROSCOPÍA

Tipos de Microscopios

El Microscopio óptico simple. Constituido por una lente biconvexa única o lupa que hace converger los rayos luminosos que la atraviesan en un punto denominado foco y a una distancia focal muy corta.

El Microscopio óptico Compuesto. Se define como  un instrumento óptico formado por un sistema de lentes: objetivos y oculares que amplían los objetos extremadamente pequeños para posibilitar su observación. La lente del objetivo proporciona una imagen intermedia ampliada del objeto, es decir, funciona como una lente simple, y la lente del ocular que recoge la imagen dada por el objetivo y la aumenta.

El Microscopio electrónico. En lugar de una fuente de luz, utiliza un haz de electrones que se desplazan en el vacío y en línea recta. Con el microscopio electrónico es posible observar objetos muy pequeños como los virus que no pueden ser resueltos con el microscopio óptico.
En el microscopio electrónico en lugar de lentes se emplean campos magnéticos que enfocan los haces de electrones.

El Microscopio óptico Compuesto. A continuación  se describen las partes que lo conforman:

Los objetivos: están localizados  en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metálica, denominada revólver o porta objetivos, que permite cambiarlos fácilmente. Estos generan una imagen real, invertida y aumentada, esta imagen intermedia es captada y sufre una nueva ampliación por el ocular. 

Los objetivos más frecuentes son los de 4X, 10X, 40X y 100X aumentos. Este último de 100x se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita aplicar aceite de cedro sobre la preparación. Y se utiliza para observar láminas coloreadas completamente secas.
El poder de aumento de cada objetivo se indica en el número grabado en la manga del lente. Generalmente el objetivo de 4X se encuentra marcado por un anillo rojo, el de 10X por un anillo de color amarillo, el de 40=x con un anillo de color azul y el de 100X con un anillo de color blanco.

La abertura numérica se encuentra (A.N.) se encuentra grabada en la manga del objetivo, junto a la indicación del aumento.

0,30

En el objetivo de 10X

0,65

En el objetivo de 40X

1,30

En el objetivo de 100X

A medida que aumenta la A.N. disminuyen las dimensiones de la lente frontal, montada en la base del objetivo. La lente del objetivo de 100x tiene el tamaño de una cabeza de alfiler es mayor el poder de resolución. Además a medida que aumenta A.N. es mayor el poder de resolución. Cuanto mayor sea el poder de resolución del objetivo, será más clara la imagen y aumentará la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separándolos y aclarándolos. El poder de resolución máximo de un buen microscopio es aproximadamente 0,25 nanómetros, el poder de resolución del ojo humano es de  0,25 milímetros.

 

Los   oculares se  denominan así porque están muy cercanos al ojo.  Su función es la de captar y ampliar la imagen formada en los objetivos.  El poder de aumento del ocular se encuentra marcado en el ocular. Un ocular por 4 aumenta 4 veces la imagen que produce el objetivo. Un ocular por 6 la aumenta 6 veces. Un ocular por 10 la aumenta 10 veces Nunca se deben tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, se deben limpiar muy suavemente con un papel de óptica.

El tubo óptico: es una cámara oscura unida mediante una cremallera. Tiene el revólver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior.

El Brazo: es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie con el tubo.

La Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo.

Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un carro con un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento que permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. Está dotado de una escala graduada para medir de forma precisa las observaciones.

El condensador: es un sistema de lentes convergentes  situadas bajo la platina, su función es la de concentrar la  luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación.

Diafragma-iris: Es una cortinilla que regula la cantidad de luz que entra en el condensador, eliminando los rayos demasiado desviados. Se acciona mediante una perilla. Esta situado debajo de la platina, inmediatamente debajo del condensador. La disminución del diafragma permite visualizar partes de protozoos u hongos se utiliza en las preparaciones frescas

Tornillo Macrométrico: Se encuentra en la parte inferior del microscopio. Sirve para alejar o acercar el tubo y la platina moviéndola de arriba hacia abajo y viceversa. Permite un enfoque aproximado o grueso de la muestra.

Tornillo micrométrico: Generalmente se encuentra incorporado al tornillo macrométrico. Sirve para dar claridad a la imagen al lograr un ajuste fino y preciso, mediante movimiento de la platina hacia arriba y hacia abajo de forma lenta. Ambos tornillos llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.
La fuente de iluminación: se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.

Por último definimos el pie o base: sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En él se integra la fuente luminosa.

Poderes o capacidades del microscopio

Poder de aumento: Permite magnificar la imagen.  Corresponde al aumento (A) dado por la relación: Tamaño de la imagen / tamaño del objeto. La ampliación es igual al  producto del aumento del lente ocular  por el del objetivo. Cada objetivo y cada ocular tienen grabado el número de veces que aumentan la imagen. Si la imagen del objeto, se hace aumentar 40 veces mediante el objetivo y enseguida 10 mediante el ocular, su aumento total será 10X40= 400


¿Cómo se calcula el aumento de una muestra?
Se multiplica el aumento que señala el ocular por el aumento del objetivo dando como resultado el aumento total de la muestra o número de veces en que el objeto se encuentra ampliado con respecto a su tamaño original.


Aumento total = aumento del ocular X aumento del objetivo

Poder de penetración o profundidad

Permite visualizar los diferentes planos de una preparación y está dado por el ajuste de precisión que se logra con el tornillo micrométrico.

Poder de resolución

Es la  capacidad de presentar dos  puntos que se encuentran muy cercanos entre sí como separados, lo cual permite observar detalles de los objetos que con el ojo humano no se podrían ver. El ojo humano no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. Con el  Microscopio óptico, el poder separador máximo es de 0,2 décimas de micra. Mejora la visión unas 500 veces con relación a la del ojo humano

En la imagen de la izquierda se observan espacios blancos entre la tinta negra que a simple vista no serían vistos. En la imagen de la derecha se observan varias fibras de hilo que a simple vista no serían vistas.

El poder de resolución depende de la longitud de onda ( λ ) y de la apertura numérica del objetivo (A.N.)

El Poder de resolución esta dado por la formula:

A.N: relaciona el ángulo de apertura de los rayos de luz, que provienen de la muestra, con el índice de refracción.

Poder de definición. Es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos

def
Poder de definición
Fuente Carmen Eugenia Piña

Principios generales de microscopía

Principios ópticos  

          
Una lente sencilla (biconvexa) posee dos focos, uno a cada lado de la lente (F y F´). Cuando los rayos luminosos pasan a través de la lente se concentran en el foco. La distancia focal es la distancia entre el centro de la lente y el punto en donde convergen los rayos.

La distancia focal de una lente depende del índice de refracción del material del cual está hecha, y del medio que envuelve la lente. Por eso, es diferente la distancia focal de una lente en el agua, que esta misma en el aire. Como también es diferente la distancia focal de una lente de vidrio en comparación con una construida en plástico.

Cuanto más pequeña es la distancia focal de una lente tanto mayor es su aumento. Si el objeto se coloca a distancia mayor del foco, se obtiene una imagen real invertida, mientras que si el objeto se localiza a una distancia menor del foco la imagen será virtual. A medida que se aleja el objeto del foco, la imagen se percibe más pequeña. 

La distancia de trabajo focal de un objetivo, es el espacio que existe entre la superficie de la lente del objetivo y la laminilla, una vez se encuentre enfocada la preparación. A mayor aumento del objetivo la distancia de trabajo disminuye.

Como determinar la posición de los objetos observados

Los objetos que se observan en el campo microscópico se pueden localizar en relación con las manecillas del reloj.  Los objetos que aparecen en la parte inferior del fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte superior. Los objetos en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente al lado derecho.

Desplazamiento del objeto

Si se mueve el portaobjetos hacia la derecha, el objeto examinado se desplazará hacia la izquierda. Si se mueve el portaobjetos hacia usted, el objeto examinado se alejará.

Formación de la imagen real  invertida

Las imágenes se observan invertidas por las lentes.

Refracción de la luz

La distancia focal de una lente depende del índice de refracción del material del cual está hecha y del medio que envuelve la lente.

Cuando los rayos de luz se mueven en un medio homogéneo como el aire, se propagan en línea recta, pero cuando caen sobre la superficie de un medio de diferente densidad, a la del medio en el cual se venía propagando, cambian de  dirección y de velocidad  a estos cambios se les conoce como refracción de la luz.

Los rayos de luz procedentes de los objetos sumergidos en el agua se desvían al atravesar dos medios de diferente densidad (agua-aire), originando este efecto de refracción. Por ejemplo si introducimos un lápiz en un vaso con agua, el lápiz se verá cortado al pasar del agua al aire.

En la práctica de microscopía encontramos diferentes medios: aire, agua aceite de inmersión y vidrio, cuyos índices de refracción son 1.0, 1.33, 1.51, .1.54 respectivamente.  Al observar una muestra a través del microscopio, los rayos de luz tienen que atravesar estos medios y son refractados cambiando su dirección.

Al aplicar el aceite inmersión se entre el preparado y la lente, aceite de inmersión, que tiene un índice de refracción igual al de la lente y evita la refracción de los rayos luminosos.

Campo de Visión

El campo de visión de un microscopio es la zona circular que se observa al mirar la preparación bajo un determinado aumento. Para medir el campo de visión de un microscopio, se debe usar una unidad llamada micra. Una micra equivale a 0,0001 mm; en otras palabras, hay 1000 micras en un milímetro. El diámetro de este campo es su medida.

El campo de visión de un microscopio es la zona circular que se observa al mirar la preparación bajo un determinado aumento. Para medir el campo de visión de un microscopio, se debe usar una unidad llamada micra. Una micra equivale a 0,0001 mm; en otras palabras, hay 1000 micras en un milímetro. El diámetro de este campo es su medida.

Cálculo del diámetro del campo de visión


Para calcular el diámetro del campo de visión para un determinado aumento hay que seguir los siguientes pasos:

a) Recortar un cuadrado de 1 cm de lado de papel milimetrado.

b) Ponerlo sobre la abertura central del portaobjetos.

c) Observando por el ocular y con el objetivo de 4X, mover  la muestra hasta lograr que la línea 0 mm quede en el borde izquierdo del campo visual.

d) Enfocar con el objetivo de menor aumento 4X hasta que se vea con claridad. Enfocar la preparación  quiere decir situarla a la distancia del objetivo que permite su observación nítida. Esta distancia s e conoce como distancia de trabajo y es tanto menor cuanto mayor es el poder de aumento del objetivo

e) Medir el campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo de visión.

f) Contar el número de milímetros que se ven (recuerde que la distancia entre dos líneas es un milímetro) y estimar aproximadamente la fracción sobrante, si la hay. El resultado será el diámetro del campo visual para ese aumento (objetivo x ocular).

g) Si queremos calcular el diámetro del campo de visión para aumentos mayores, hay que tener en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, el campo será menor, es decir, se verá menos de la muestra que estemos observando. De forma que, si el aumento es el doble, el campo será la mitad, si el aumento es el triple, el diámetro será la tercera parte, etc. (inversamente proporcionales). Por tanto, bastará con realizar un sencillo cálculo matemático para saber el nuevo diámetro.

Tabla 1 Equivalencia mm en micras

Medida en mm (escala del portaobjetos)

Equivalencia en µm

Tamaño de las marcas (divisiones)

1mm

1000 µm

grandes

0.1 mm

100 µm

medianas

0.01mm

10 µm

más pequeñas

Preparaciones o montajes

Las preparaciones pueden ser de varios tipos:

    a) Frescas: Son montajes generalmente húmedos. La muestra se observa sin modificar,  diluida o concentrada. Permite observar la movilidad de los microorganismos vivos. Se utiliza también para observar procesos como la mitosis, meiosis, la formación de esporas.

Para realizar un montaje húmedo se debe  verter una gota de agua o del líquido que contiene los microorganismos en el centro de una lámina portaobjetos y cubrirlo con una laminilla cubreobjetos. Para evitar la evaporación se puede sellar el espacio que hay entre el portaobjetos y el cubreobjetos con vaselina o alguna sustancia similar.
Frescas ligeramente modificadas: Las muestras se pueden diluir con agua o con agua con sal, esta última evita que la presión osmótica del medio no sea demasiado baja. Se puede aplicar un colorante o reactivo para observar mejor las estructuras.

    b) Fijadas y teñidas: Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión